分光光度計是現代分析實驗室中重要的儀器，其核心原理是基于物質對特定波長光的吸收特性進行定量分析。波長設置和參比溶液選擇是分光光度分析中的兩個關鍵步驟，直接影響測定結果的準確性和可靠性。
分光光度計正確的波長設置能夠確保檢測的靈敏度和選擇性，而恰當的參比溶液選擇則可以有效消除干擾因素，提高測定精度。
一、波長設置方法
波長設置是分光光度分析的首要步驟。最佳吸收波長的確定通常通過全波長掃描來完成。將待測溶液放入比色皿中，在儀器的波長范圍內進行連續掃描，記錄各波長下的吸光度值，繪制吸收光譜曲線。曲線的最高點對應的波長即為最大吸收波長（λmax），該波長下測定可獲得最高的靈敏度。
在實際操作中，還需要考慮共存物質的干擾。當樣品中存在多種吸光物質時，需要選擇干擾最小、待測物吸收最大的波長作為測定波長。有時為了避免干擾，也可選擇次強吸收峰進行測定。對于多組分分析，可采用導數光譜法等技術手段來提高選擇性。
儀器校準是確保波長準確性的重要環節。使用標準物質（如鈥玻璃濾光片）定期校準儀器，可確保波長指示值與實際值一致。在校準過程中，應注意環境溫度的影響，必要時進行溫度補償。
二、參比溶液選擇原則
參比溶液的主要作用是消除溶劑、比色皿等因素對測定的影響。常用的參比溶液是溶劑空白，即使用與樣品溶液相同的溶劑作為參比。這種方法適用于簡單體系的分析，能夠有效扣除溶劑背景。
當樣品基質復雜時，需要采用更精確的參比溶液。試劑空白法是在溶劑中加入除待測物外的所有試劑，用于扣除試劑背景。樣品空白法則使用經過特殊處理的樣品溶液，如加入掩蔽劑或進行特殊反應，以消除樣品基質的干擾。
參比溶液的選擇必須考慮樣品的特性。對于有色樣品，可能需要使用褪色溶液作為參比；對于渾濁樣品，則需要考慮光散射的影響。在某些特殊情況下，還可以使用雙波長法或多波長法來消除背景干擾。
三、實驗操作要點
樣品處理是獲得準確結果的前提。樣品應充分溶解，必要時進行過濾或離心以去除懸浮物。對于易揮發或光敏性樣品，需要采取適當的保護措施。樣品濃度應控制在比爾定律的線性范圍內，必要時進行稀釋。
比色皿的使用直接影響測定結果。使用前應檢查比色皿的清潔度，確保無劃痕、無污染。裝液時避免氣泡產生，擦拭比色皿外壁時使用專用擦鏡紙。對于揮發性樣品，應及時加蓋防止溶劑揮發。
數據處理時應注意扣除空白值，必要時進行基線校正。對于多組分分析，可采用化學計量學方法進行數據處理。建立標準曲線時，應確保線性相關系數符合要求。
分光光度分析是一項精密的定量分析技術，波長設置和參比溶液選擇是其中的關鍵環節。通過科學的方法選擇和嚴格的實驗操作，可以獲得準確可靠的分析結果。隨著分析技術的發展，分光光度法在環境監測、食品安全、藥物分析等領域的應用將更加廣泛。實驗人員應深入理解原理，掌握操作要點，不斷提高分析水平。
